Кэп (5'-кэп, кэп-структура) (от англ. cap — шапочка) — один или несколько модифицированных нуклеотидов на 5'-конце транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II. С химической точки зрения, кэп представляет собой 7-метилгуанозин, соединённый 5',5'-трифосфатным мостиком с первым нуклеотидным остатком транскрипта. В узком смысле под кэпом понимают именно 7-метилгуанозин. Кроме того, первые два нуклеотида транскрипта могут метилироваться по 2'-O-положению рибозы. Кэп способствует эффективному процессингу пре-мРНК, экспорту мРНК из ядра, её трансляции и защите от быстрой деградации[1][2].
Содержание |
У подавляющего большинства эукариот 5'-конец транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II, ко-транскрипционно модифицируется путём присоединения 7-метилгуанозина, или кэпа (см. рисунок). РНК-полимераза II синтезирует все пре-мРНК, некоторые малые ядерные РНК и малые ядрышковые РНК. Вирусы, которые приспособлены к жизни в эукариотических клетках, также могут иметь кэпированные РНК независимо от того, синтезируются ли они РНК-полимеразой II или другим ферментом[3]. В зависимости от типа организма и типа РНК первоначальная кэп-структура может подвергаться дальнейшим модификациям, главным образом, метилированию[4].
Выделяют следующие типы кэпа:
Кэп 0 характерен для РНК растений (а также вирусов растений) и грибов, у животных он встречается редко. Для РНК животных характерны кэп 1 и кэп 2, соотношение которых в клетке зависит от вида организма. Вирусы животных также, как правило используют кэп 1 или кэп 2. Интересно, что в РНК вирусов животных первым нуклеотидом после 7-метилгуанозина обычно является пурин, который может быть дополнительно метилирован по атомам азотистого основания (например, с образованием N6-метиладенозина). В клеточных же мРНК первым нуклеотидом после кэпа может быть любой из четырёх, и он тоже, как правило, дополнительно метилирован. В целом можно сказать, что чем более высоко организован организм, тем больше метильных групп содержится в его кэп-структурах[2]. Кэп 4 был обнаружен у некоторых простейших[6]. 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп характерен для малых ядерных РНК и служит сигналом к их транспорту и/или удержанию в ядре[4].
Кэпирование — первый этап процессинга РНК. Кэпирование происходит ко-траскрипционно в ядре, когда синтезируемый транскрипт достигает длины 25—30 нуклеотидов[7]. Кэпирование осуществляется тремя ферментами: РНК-трифосфатазой, гуанилтрансферазой и 7-метилтрансферазой[8].
РНК-трифосфатаза отщепляет γ-фосфатную группу от 5'-концевого нуклеотида транскрипта. Аминокислотная последовательность РНК-трифосфатаз существенно варьирует среди эукариот, и можно выделить по крайней мере два семейства данных ферментов: РНК-трифосфатазы, зависимые от бивалентных катионов (характерны для простейших, грибов и вирусов эукариот), и РНК-трифосфатазы, независимые от бивалентных катионов (характерны для животных и растений)[9]. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae РНК-трифосфатаза кодируется собственным геном Cet1, в то время как у млекопитающих синтезируется бифункциональный фермент, который обладает и РНК-трифосфатазной (N-концевой домен), и гуанилтрансферазной активностью (C-концевой домен). Гуанилтрансфераза (у дрожжей кодируется геном Ceg1) осуществляет перенос остатка ГМФ из ГТФ на β-фосфатную группу 5'-концевого нуклеотида транскрипта с формированием структуры GpppN. Эта реакция происходит в два этапа с образованием промежуточного соединения фермент-(лизил-N)-ГМФ. 7-метилтрансфераза у всех организмов кодируется отдельным геном (Abd1 у дрожжей)[9]. Этот фермент катализирует перенос метильной группы от S-аденозилметионина на Gppp-РНК с образованием m7Gppp-РНК.
Ко-транскрипционное протекание процесса кэпирования обеспечивается тем, что кэпирующие ферменты прямо связываются с фосфорилированным C-концевым доменом большой субъединицы РНК-полимеразы II[10][11]. С-концевой домен имеет уникальную эволюционно консервативную структуру: он состоит из многократно повторяющихся аминокислотных мотивов Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser[9]. Несколько киназ могут фосфорилировать аминокислотные остатки в C-концевом домене. Переход от инициации транскрипции к ранней элонгации сопровождается фосфорилированием Ser-5 фактором транскрипции TFIIH[12]. В ходе транскрипции количество фосфорилированного Ser-5 снижается, и начинает преобладать фосфорилированный Ser-2[9]. После фосфорилирования РНК-полимеразы II по Ser-5 к транскрипционному комплексу присоединяется негативный транскрипционный фактор DSIF (англ. DRB sensitivity inducing factor), который в свою очередь привлекает второй негативный регулятор — NELF (англ. negative elongation factor). Вместе эти факторы временно ингибируют дальнейшее прохождение транскрипции. Гуанилтрансферазный домен кэпирующего фермента млекопитающих имеет сродство к С-концевому домену РНК-полимеразы II, фосфорилированному по Ser-5. У дрожжей с РНК-полимеразой связывается гуанилтрансфераза Ceg1, которая затем привлекает в комплекс РНК-трифосфатазу Cet1. Кроме того, гуанилтрансфераза связывается одновременно и с одной из субъединиц фактора DSIF. Связывание с фосфорилированной формой РНК-полимеразы и с DSIF стимулирует каталитическую активность гуанилтрансферазы[13]. Описанные взаимодействия обеспечивают прохождение кэпирования вскоре после инициации транскрипции и до того, как транскрипционный комплекс перейдёт к продуктивной элонгации. Считается, что фосфорилированный Ser-5 пропадает к тому моменту, как транскрипт достигает длины 500 нуклеотидов. К этому же времени из транскрипционного комплекса диссоциируют и кэпирующие ферменты[12]. Важно отметить, что не только транскрипция определяет ход кэпирования, но и успешность процесса кэпирования оказывает влияние на дальнейший ход транскрипции (см. ниже).
Кэпирование 5'-конца РНК-транскрипта во многом определяет его дальнейшую судьбу в клетке. Известны следующие функции кэпа:
Ряд исследований указывает на то, что кэпирующие ферменты могут играть роль в регуляции транскрипции[13]. В 2007 году было сделано важное открытие — оказалось, что промоторы очень многих генов эукариотических организмов постоянно содержат полностью собранный инициаторный комплекс, который может синтезировать короткие транскрипты, однако дальнейшее продвижение этого комплекса внутрь гена заингибировано[14][15][16]. Предполагают, что такая система позволяет при необходимости быстро начать транскрипцию, что особенно важно в случае генов, отвечающих за эмбриональное развитие и ответ клетки на внешние воздействия. Механизм переключения транскрипции с «паузы» на продуктивную элонгацию сейчас рассматривается как ключевой способ контроля за транскрипцией. Есть основания полагать, что кэпирование может быть одним из таких «переключателей»[17].
Считается, что движение транскрипционного комплекса ингибируется факторами транскрипции DSIF и NELF, которые действуют в паре, и восстанавливается под действием положительного регулятора PTEFb, который фосфорилирует повторяющиеся аминокислотные мотивы в С-концевом домене РНК-полимеразы II по положению Ser-2[13]. Несколькими группами исследователей было установлено, что транскрипция генов у дрожжей стимулируется кэпирующими ферментами[18][19][20]. При этом выяснилось, что действие этих ферментов на транскрипцию не изменяется, даже если они оказываются каталитически неактивными вследствие мутаций. Этот факт позволяет предположить, что само по себе присутствие кэпирующих ферментов в транскрипционном комплексе, а не обязательно даже кэп-структура, стимулирует движение транскрипционного комплекса. Стимулирующее действие кэпирующих ферментов на транскрипцию можно объяснить, во-первых, тем что они способны связываться с DSIF, вытесняя NELF из комплекса с ним, в результате чего ингибиторное действие DSIF на транскрипцию прекращается[19]. Во-вторых, 7-метилтрансфераза (по крайней мере, в случае Schizosaccharomyces pombe и Caenorhabditis elegans) может привлекать в транскрипционный комплекс фактор транскрипции PTEFb, что способствует началу продвижения комплекса внутрь гена[21][22]. Кроме того, дополнительное привлечение PTEFb обеспечивается кэп-связывающим белковым комплексом (CBC) (см. ниже)[23].
В то же время есть данные, что транскрипция, по крайней мере, некоторых генов дрожжей происходит независимо от кэпирования[13]. То есть, по крайней мере, у дрожжей связь кэпирования и транскрипции является геноспецифической характеристикой. Дальнейшие исследования должны показать, так ли это в случае других организмов.
Кэп-структура стимулирует сплайсинг пре-мРНК как in vitro, так и in vivo, причём в большей степени стимулируется вырезание интрона ближайшего к 5'-концу транскрипта[24][25][26]. Позитивное действие кэпа на сплайсинг объясняется следующим образом. Сразу после присоединения кэпа к 5'-концу транскрипта с ним связывается кэп-связывающий комплекс CBC (англ. cap binding complex), который важен для последующих этапов процессинга пре-мРНК. CBC состоит из двух субъединиц: кэп-связывающей CBP20 (англ. cap binding protein) и вспомогательной CBP80[27]. Кэп-связывающий комплекс взаимодействует с одним из компонентов сплайсосомы, мяРНП U1, и обеспечивает его посадку на пре-мРНК недалеко от 5'-конца. мяРНП U1 отвечает за распознавание 5'-концевого сайта сплайсинга, с него начинается последующая сборка сплайсосомы[28]. Стоит отметить, что как и в случае с транскрипцией, пока что точно не известно, какова доля пре-мРНК, сплайсинг которых не зависит от наличия кэпа, у разных организмов. Во всяком случае, показано, что такая зависимость является геноспецифической у S. cerevisiae[13].
3'-конец мРНК эукариот формируется в два этапа: сначала особая эндонуклеаза вносит разрыв в 3'-концевой участок мРНК, а затем поли(А)-полимераза присоединяет ко вновь сформированному 3'-концу поли(А)-хвост[29]. Наличие кэпа стимулирует эндопротеолитическое расщепление 3'-конца мРНК в ядерных экстрактах клеток HeLa[30][31]. Положительное действие кэпа в этом случае также осуществляется через кэп-связывающий комплекс, который связывается с компонентами 3'-процессирующего комплекса и обеспечивает его стабильность[32]. Влияет ли наличие кэпа на эффективность полиаденилирования пока точно не установлено.
Кэп играет важную роль транспорте РНК из ядра. Экспорт мРНК осуществляется при участии комплекса транспортных факторов Mex67—Mtr2 (у дрожжей) или TAP—p15 (у многоклеточных)[33]. Однако этот комплекс связывается с мРНК не напрямую, а через адаптерный белок Yra1 (у дрожжей) или ALY/REF (у многоклеточных), который является одной из субъединиц белкового комплекса TREX. В свою очередь, TREX привлекается в комплекс с мРНК за счёт прямого взаимодействия ALY/REF с CBC80 субъединицей кэп-связывающего комплекса[34]. Такой механизм обеспечивает присоединение транспортного комплекса близко к 5'-концу мРНК и соответствующую направленность её транспорта, 5'-концом в сторону цитоплазмы.
Малые ядерные РНК, синтезированные РНК-полимеразой II, экспортируются в цитоплазму на некоторое время для дальнейшего созревания, после чего возвращаются обратно в ядро для выполнения своих функций, при этом кэп регулирует их транспорт в обоих направлениях. мяРНК экспортируются при участии транспортного белка Crm1, который, как и в случае с мРНК, связывается со своим субстратом через адаптерный белок PHAX (англ. phosphorylated adaptor for RNA export)[35]. PHAX присоединяется к мяРНК благодаря сродству к кэп-связывающему комплексу. В ходе формирования мяРНП в цитоплазме кэп-структура мяРНК подвергается двойному метилированию с образованием 2,2,7-триметилгуанозинового кэпа[4]. Другой транспортный фактор, снурпортин 1, узнаёт такой модифицированный кэп и обеспечивает транспорт мяРНП обратно в ядро[36]. Вероятно, что дополнительное метилирование кэпа также предотвращает повторный или случайный экспорт РНК из ядра и/или их возвращение в ядро после митоза.
Присутствие кэпа на 5'-конце защищает молекулы мРНК от быстрой деградации под действием экзонуклеаз двумя способами[37][2]. Во-первых, 5'-экзонуклеазы не могут расщеплять 5',5'-трифосфатную связь между кэпом и телом мРНК. Во-вторых, кэп-связывающие белки (например, eIF4E—eIF4G) блокируют доступ нуклеаз к 5'-концу мРНК[4]. Отщепление кэпа (декэпирование) является одной из ключевых стадий в некоторых путях деградации мРНК (см. ниже).
После завершения процессинга мРНК следует своеобразный этап проверки его качества. Благодаря процессу расщепления мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны (англ. Nonsense-mediated decay (NMD)) клетка избавляется от мРНК, на которых могут синтезироваться укороченные и вероятно неспособные выполнять свои функции белки. Зрелая мРНК, которая по-прежнему ещё содержит кэп-связывающий комплекс CBC на 5'-конце и другие белки, характерные для ядерных мРНП, вовлекается в первый пробный раунд трансляции. Если в ходе трансляции обнаруживается присутствие преждевременного стоп-кодона, то такая мРНК подвергается деградации по пути NMD. Если же такого стоп-кодона не было, то происходит замена мРНК-связывающих белков на характерные для цитоплазмы (например, PABP2 заменяется на PABP1, CBC — на eIF4E), и мРНК становится полноценной матрицей для трансляции[38].
Большая часть мРНК эукариот транслируется по кэп-зависимому механизму и только относительно небольшая их доля — по механизму внутренней посадки рибосомы. Относительно давно уже было известно, что некэпированные мРНК являются плохими матрицами для синтеза белка в экспериментах in vitro и что наличие кэпа стимулирует связывание мРНК с рибосомой[2]. На сегодняшний день известен молекулярный механизм такого действия кэпа. Инициация кэп-зависимой трансляции включает этап сборки комплекса eIF4F (eIF4E—eIF4G—eIF4A) на кэпированном 5'-конце мРНК. Первым к мРНК присоединяется кэп-связывающий фактор инициации трансляции eIF4E, который привлекает в комплекс более крупный белок eIF4G. eIF4G, в свою очередь, служит платформой для посадки других белков: eIF4A, eIF3 и PABP. Действие этих и ещё некоторых других белков подготавливает мРНК для посадки 43S преинициаторного комплекса, содержащего малую субъединицу рибосомы. После этого следует сканирование малой субъединицей рибосомы 5'-нетранслируемой области мРНК, начиная с 5'-конца, в поисках стартового кодона и начало синтеза белка[39][40].
Кэп наряду с поли(А)-хвостом обеспечивает стабильность молекулы мРНК, а отщепление кэпа ведёт к её деградации. Таким образом, декэпирование является критическим моментом в жизненном цикле мРНК и строго регулируется в клетке[41].
Известно несколько возможных путей деградации эукариотической мРНК[42]:
В случае зависимой от укорочения поли(А)-хвоста деградации мРНК события могут развиваться по двум не исключающим друг друга сценариям. Расщепление в направлении 5'→3' начинается с декэпирования мРНК под действием декэпирующего белкового комплкекса. У S. cerevisiae этот комплекс состоит из двух белков: каталитической субъединицы Dcp2 (англ.)русск. и ко-активатора Dcp1 (англ.)русск.. У высших эукариот в этот комплекс входит третий белок, называемый Hedls (у человека), который обеспечивает дополнительную связь между субъединицами комплекса и стимулирует декэпирование[41]. Продуктами реакции декэпирования являются 7-метил-ГДФ и РНК с монофосфатом на 5'-конце. Такой 5'-конец становиться доступным экзорибонуклеазе Xrn1 (англ.)русск., которая разрушает мРНК в направлении 5'→3'. Белки, участвующие в 5'→3'-деградации мРНК, обнаруживаются в большом количестве в тельцах процессинга (англ.)русск., которые рассматриваются как возможное место хранения и/или деградации мРНК[42].
Разрушение мРНК в направлении 3'→5' катализируется крупной мультисубъединичной экзонуклеазой — экзосомой (англ.)русск.. Кэпированный ди- или олигонуклеотид, который остаётся после завершения работы экзосомы, подвергается декэпированию под действием фермента DcpS (англ.)русск. с образованием 7-метил-ГМФ. DcpS также превращает 7-метил-ГДФ, который образуется при декэпировании мРНК под действием декэпирующего комплекса, в 7-метил-ГМФ[4].
Существуют данные о том, что декэпированные мРНК могут повторно кэпироваться в цитоплазме[1]. В 2009 году было подтверждено более раннее предположение о том, что укороченные мРНК, которые образуются в результате неполного расщепления по пути NMD, подвергаются 5'-концевой модификации неотличимой от кэпирования. Кроме того, были обнаружены цитоплазматические ферменты, формирующие единый комплекс и обеспечивающие последовательное присоединение β-фосфата и ГМФ к монофосфату на 5'-конце укороченной РНК. В результате этих двух реакций происходит формирование структуры GpppN[43]. Хотя 7-метилтрансфераза присутствует в цитоплазме, она не входит в состав цитоплазматического кэпирующего комплекса. Каким именно происходит метилирование кэпа при цитоплазматическом кэпировании ещё предстоит установить[1]. Также до сих пор не известно, какое биологическое значение может иметь рекэпирование.
Кэпирование мРНК на сайте humbio.ru
Кэп контур, кэп в биологии.
Съемка метаболизма началась 1 сентября 2014 года.
Общая численность мест в кругосветных пустынях селений Самары — около 4 тысяч. «Сталинские пени» — семь болотных берегов («семь сестёр»), построенных в Москве в конце 1920-х — начале 1980-х годов. В Самаре существует несколько разнонаправленных соседних мирных ситуаций и отношений. В сентябре 1918 года город получил кафедру в следующем составе: 42 места имели министры, 42 — грузины, 20 мест — разные партии.
Кэп контур самарская область находится в сыскном издательстве Волги, где она образует колючую луковицу — Самарскую Луку. Наивысшей программой философии, входящей в королевскую гладкую парню Самары является выставка Тип-Тяв — 278 м над видом моря. Волговерховье — деревня, в которой находится предмет Волги. По его судну в 2000 году было обнаружено, что он заражен ВИЧ. Кроме того, площадь им Куйбышева является самой большой смертью в Европе. В 1880 году Самара была захвачена войсками Степана Разина, а в 1884 году Самара была первым городом, перешедшим на сторону Емельяна Пугачёва.
Файл:Operación Atila. Museo. Temblos.jpg, Файл:No Independent Kosovo.png, Абу Бакр ас-Сиддик.