Противоточная хроматография (ПТХ) является техникой жидкостной хроматографии которая применяется для двух несмешиваемых жидкостей без применения твердого наполнителя.[1][2] Одна жидкость в качестве стационарной фазы, а другая в качестве подвижной. Жидкая стационарная фаза удерживается на месте за счёт силы гравитации или центробежной силы
Стандартная колоночная хроматография использует твёрдую стационарную фазу и жидкую подвижную фазу, в то время как газовая хроматография (ГХ) использует жидкую стационарную фазу как твёрдый наполнитель и газообразную подвижную фазу. В противоположность этому, в жидкостной хроматографии обе фазы, стационарная и подвижная, жидкие. Исключением твёрдого наоплнителя, можно избежать постоянной адсорбции аналита в колонне, и таким образом достичь высокой степени извлечения аналита.[3] Инструмент также легко меняется взависимости от разных режимов работы сменой растворителя. В жидкостной хроматографии работа ограничена составом колонн, доступных для инструмента. Почлю любая пара несмешиваемых растовров может быть использована в жидкостной хроматографии, и большинство инструментов можно применять в стандартном или обращенно-фазном режиме.
В основном затраты на растворители ниже, чем при высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также отпадают затраты на покупку и утилизацию твёрдых адсорбентов. Другим преимуществом является то, что результаты лабораторных экспериментов можно масштабировать на производственные объемы. При проведении ГХ или ВЭЖХ в больших объёмах, разрешение теряется из-за соотношения поверхности к объему и динамики жидкости и газа; этого можно избежать когда обе фазы жидкие.[4]
ПТХ можно рассматривать как состоящую из трёх этапов: смешивание, осаждение и разделение (хотя часто они происходят непрерывно). Смешивание фаз необходимо для того, чтобы достичь большей площади интерфазы и чтобы аналит мог перемещаться между фазами в зависимости от коэффициента разделения.
Подвижная фаза смешивается и потом осаждается из стационарной фазы через колонну. Степень удерживания стационарной фазы (обрано пропорциональна к объёму потери или утечки стационарной фазы при разделении) является ключевым параметром. Инструменты высокого качества имеют высокую степень удерживания стационарной фазы. Время осаждения это свойство системы растворителей и матрицы проб, которые значительно влияют на время удерживания стационарной фазы.[5]
Капельная ПТХ является наиболее старой формой ПТХ.[1] Для движения подвижной фазы через стационарную она использует только силу. При нисходящем режиме, капли более плотной подвижной фазы и образец спадают вниз через колонну в более лёгкую стационарную фазу только под действием гравитации.
Если используется менее плотная подвижная фаза, то она будет подниматься через стационарную фазу, что называется восходящим режимом. Элюент переходит из одной колонны в другую, чем больше колонн используются, тем больше теоретических тарелок колонны можно осуществить. Недостатком КПТХ является низкий расход, а также низкая смешиваемость для большинства бинарных систем растворителей, что делает эту технику малоэффективной и времязатратной.
Принцип действия оборудования ПТХ подразумевает применение колонны, состоящей из тубы намотанной вогруг бобины. Бобина вращается двухосевым вращающимся движением (кардиоид), что создает переменное поле тяжестии (G), которое действует на колонну при каждом вращении. Это движение способствует тому, что колонна делает один разделяющий шаг на оборот и компоненты образца разделяются в колонне благодаря коэффициенту разделения между двумя используемыми несмешиваемыми жидкими фазами.
ВЭПТХ во многом работает так как ВСПТХ, но с одной существенной разницей. Семь лет научно-исследовательских разработок дали инструменты ВЭПТХ, которые генерируют силу G 240, тогда как машины ВСПТХ только 80 G. Данное увеличение уровня G и большего диаметра колонны десятикратно повысило производительность, благодаря улучшению расходя подвижной фазы и намного более высшему удерживанию стационарной фазы.[6]
Противоточная хроматография является препаративной техникой жидкостной хроматографии, тем не менее, с учетом высшей силы G, с помощью инструментов ВЭПТХ на сегодняшний день можно оперировать малыми загрузками от нескольких миллиграмм, тогда как в прошлом необходимы были сотни миллиграм.
Наиболее частые области применения этой техники включают очищение натуральных продуктов и разработку препаратов.
Современная эра ПТХ началась с разработки доктора Dr. Yoichiro Ito планетарной центрифуги которая поддерживаем много форм колонн. Данные устройства пользуются малоизвестными способами установления невращающихся соединений между статором и ротором центрифуги. (Описание метода как этого достичь выходит за рамки изначальной темы. Каждая из многих книг, которые существуют, о повествующая о ПТХ, подробно описывает этот процесс[1][7] [8] [9] [10] [11] [12].)
Функционально, аппарат высокоскоростной ПТХ состоит из спиральной котушки инертных соединительных труб, которая вращается по планетарной оси и одновременно вращается эксцентрично по другой солярной оси. (Эти оси могут совпадать, но здесь указывается наиболее распространенный тип J CCC.) Эффект состоит в том, чтобы создать зоны смешивания и зоны осаждения, что быстро прогрессирует вдоль спиральной котушки. Это создает очень благоприятную среду для хроматографии.
Касательно дизайна данного инструмента, существует много возможных вариантов. Ниаболее значимым является тороидальная ПТХ. Этот инструмент не применяет планетарное движение. В некотормо смысле он очень похож на ЦРХ, с тем преимуществом, что не нужны поворотные уплотнения. Также в нем применяется капиллярная трубка вместо трубоу большого диаметра применяемых в спиралях других моделей ПТХ. Этот капиллярный канал способствует очень тщательному смешиванию двух фаз, несмотря на недостаток взбалтывания или других смешивающих сил. Данный инструмент дает быстрые аналитические разделения, которые при этом могут быть масштабированы до курпномасштабных инструментов ПТХ. Для примера смотрите очищение ксантанолида тут.[13]
Центробежная разделительная хроматография (ЦРХ) изобрела в 80-х годах японская компания Sanki Engineering Ltd, во главе с президентом Каничи Нуногаки.[14] ЦРХ была затем интенсивно развита во Франции, начиная с конца 90-х годов. ЦРХ использует центробежную силу для скоростного разделения и достигает больших расходов, чем КПТХ (которая опирается на силу гравитации).
Центробежный разделительный хроматограф состоит из единого ротора (= колонны). Ротор вращается в центральной оси (в то время, как колонна ВСПТХ вращается по планетарной оси и одновременно вращается эксцентрично по солярной оси). Помимо меньших вибраций и шума, ЦРХ предлагает также больший выбор скоростей вращения (от 500 до 2000 об/мин) чем ВСПТХ. Это дает лучшую декантацию и удерживание неустойчивых бифазных систем (например, водно-водные системы или бутанол-водные системы).
Основы ЦРХ: Ротор ЦРХ сотоит из наставленных друг на друга дисков, которые имеют меленькие ячейки, сложенные одна с другой проходами голова/хвост. В этих ячейках собственно и происходит хроматографическое разделение, и их можно сравнить с линейно выстроенными отдельными воронками.
Ротор (колонна)
Диск с двойными ячейками
Деталь диска с двойными ячейками
Деталь двойных ячеек
Ротор заполняется стационарной фазой, которая остается внутри ротора благодаря скорости вращения, в то время как подвижная фаза закачивается через нее. ЦРХ можно использовать в нисходящем и восходящем режиме, где направление соотносится с силой, генерируемой ротором нежели гравитацей. Учитывая быстрое и постоянное развитие дизайна ячеек, улучшились эффективность и расход с низким противодавлением. На сегодняшний день ЦРХ позволяет делать прямое масштабирование из аналитического аппарата (несколько миллилитров) до аппаратов промышленной величины (несколько литров) для быстрого серийного производства.
Восходящий режим
Нисходящий режим
Быстрый Центробежный Разделительный Хроматограф (БЦРХ) работает на базе принципов жидкость-жидкостной хроматографии: две несмешиваемые жидкие фазы смешиваются вместе для формирования двухфазной системы, а затем разделяются несколько раз. Отдельные элиюты изолированы на разных коэффициентых распределения каждого вещества в данной двухфазной системе. Одна из жидких фаз двухфазовой системы используется в качестве стационарной жидкой фазы: она подается в колонну (ротов) во время ее вращения при умеренной скорости. Стационарная фаза удерживается внутри ротора при помощи генерируемой центробежной силы. Другая фаза двухфазной системы используется в качестве подвижной фазы, содержащей элюиты, которые необходимо извлечь. Она подается под давлением в ротор и перекачивается через стационарную фазу. Обе фазы смешиваются вместе. Именно на этом этапе и происходит обмен молекулами между двумя фазами. Разделение элюитов осуществляется за счет соотношения коэффициентов распределения (Kd) каждого элюита между подвижной и стационарной фазой. Затем подвижная фаза сливается через выход одной ячейки и попадает в другую. Элюированные фракции подвижной и стационарной фазы собираются за отреки времени от нескольких минут до несколких часов. Эти фракйии или элюаты будут содержать отдельные очищенные элюиты.
Коэффициент распределения (Kd)
Противоточная хроматография.